Cell的自噬外泌体研究都怎么设计体内实验？

撰写： 花博 来源：小张聊科研平台的“ 课题指南针”*，*搜索“ 课题指南针”即可关注/扫描关注见文末

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不知道大家还记不记得我们上次给大家讲解的这篇Cell（可能也已经忘了）：

原文链接：

整体的思路是这样的：

但是里面还是有不少小细节值得细品。上次给大家讲了体外实验验证分子机制部分，这次再来分析分析剩下的研究内容。（忘了上次说了什么，请戳：Cell文献解读丨囊括非经典自噬、外泌体的顶刊非肿瘤研究思路（上））

番外：举一反三，由C9ORF72亚型推及到大部分ALS

如果是别的期刊文章，体外实验做到这里就差不多了。但是Cell的文章可不行。个例→普适才是真正的临床意义之所在。ALS在患者中有许多不同的亚型，除了文中重点关注的C9ORF72型外，还有TDP-43突变型、FUS突变型以及未见已知ALS突变位点的散发型。

于是作者挑选了8例散发性（sALS）、TDP- 43G298S、两例FUS突变型患者来源的细胞并进行iMN诱导，重复之前的实验，即对AP、ASO处理前后TDP-43的核/质定位、神经元死亡风险率进行了检测，结果与之前体外实验获得的一致（A-G）。（详见“Cell文献解读丨囊括非经典自噬、外泌体的顶刊非肿瘤研究思路（上）”）

其次，为了检测运动神经元的功能，作者还在果蝇体内对Pikfyve进行RNAi干扰以及TDPG-43298S突变，并用AP处理后进行幼虫翻转实验，结果证明降低Pikfyve和AP处理确实能提升或恢复运动神经元功能，由此完成异种体内实验（H,I）。

体内实验

大家可能也知道，高水平论文，尤其是顶刊级别中的动物模型，通常基因编辑小鼠是标配，常见的基因编辑小鼠有Cre-Loxp系统和CRISPR/Cas9系统两种，复杂的甚至还用到特殊品系，商品化基因编辑鼠进行二次编辑，比如常见的人源化小鼠。

这篇Cell也不例外。文中体内实验用到的小鼠有：

Pikfyve+/+：表达Pikfyve的纯合小鼠

Pikfyve+/-：Pikfyve基因敲除杂合小鼠（Cre-Loxp系统）

Pikfyve ASO：Pikfyve反义寡核苷酸抑制小鼠

TDP-43 Tg/Tg：TDP-43转基因小鼠（TAR4/4 Thy*::TDP-43）

AAV-(GR)*00：大脑皮质细胞含GFP+/poly(GR)+的小鼠

当然还有作为对照的WT小鼠。

通过对这些小鼠的杂交，实现体内的功能挽救实验。

*. 首先检测对小鼠运动功能的影响

不同功能挽救用以检测的指标类似：自噬标志物OPTN的表达、小鼠步态缺陷打分（行为学实验）和小鼠生存期。

第一个功能挽救是在过表达TDP-43基础上50%抑制Pikfyve（杂合突变）。结果表明抑制Pikfyve后小鼠运动功能和生存期显著提升（A-C）。

第二个是过表达TDP-43基础上通过ASO抑制Pikfyve，结果和上述类似，就不赘述。还有一个处理是过表达TDP-43基础上ASO抑制Pikfyve，再使用外泌体抑制剂GW48*9，于是表型回复到过表达TDP-43水平（D-G）。

最后通过AAV-(GR)*00构建的ASO疾病模型。同时使用ASO抑制Pikfyve，结果与之前一致，小鼠运动功能和生存期都得到显著提高（H,I）。

2. 其次检测对小鼠疾病病理和神经再生的影响

回顾一下之前的结果，ALS神经元主要的病理特征是pTDP-43在细胞质中错误定位，形成斑点；而C9ORF72产生的poly(GR)+等也会异常聚集。因此，体内实验同样需要检测类似病理指标的情况。

使用免疫荧光染色就能清晰看到TDP-43过表达并ASO抑制Pikfyve，以及同时使用外泌体抑制剂后小鼠脊髓神经元的形态，和TDP43的沉积情况（A-F）。

此外，神经元分泌含pTDP-43蛋白的外泌体是否会被周围细胞摄取，从而影响周围细胞功能也是个需要注意的问题。因此检测了小胶质细胞中的pTDP-43斑点。结果显示，TDP-43过表达+Pikfyve ASO小鼠的小胶质细胞确实含有更多的pTDP-43斑点，但并未影响其形态和功能（G,H,I,J）。

为了观察抑制Pikfyve更长期的作用（因为神经退行性疾病通常与年龄有关），作者还引入了TDP-43表达量较低的TAR4小鼠并与Pikfyve+/-小鼠杂交，获得发病时间较晚的小鼠疾病模型。

同样检测pTDP-43相关指标，结果表明抑制Pikfyve也能减少斑点的积累，且大腹角神经元数量回复。在AAV-(GR)*00小鼠中获得一致结果（K-P）。

总结

到这里整篇文章的主要内容就结束了。梳理一下，文章的亮点主要有以下几处：

*. 小分子抑制剂的提前筛选，奠定重要的临床意义；

2. 符合逻辑的多次筛选和错误选项排除避免套路化，呈现创新机制；

3. 多种基因编辑小鼠品系的构建为体内完整的功能挽救实验创造条件；

4. 除了神经元自身，还考虑到外泌体对周围细胞的影响，设计严谨。

本研究还缺些什么？

人无完人，研究论文也不可能尽善尽美。尽管本文的前期筛选基础成熟，机制分析逻辑严谨，实验设计全面，但仍然有一些“GAP”并没有填上。最重要的一个问题是：PIKFYVE抑制剂和驱动自噬内含体形成之间的直接作用始终没有阐明。

作者在文章开头就说明了PIKFYVE的功能是将PI3P转化为PI(3,5)P2（磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸），且该物质调控囊泡融合。然而，“囊泡融合”与“启动pTDP-43周围形成自噬内含体”仍然不是一回事。pTDP-43究竟如何被识别？又是如何受到PI(3,5)P2的影响？这些部分可能还得留到今后被解答。

02*yin.com/s/l0dNjfR4RDjvOsftz_3zyQ